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使用基于质谱的蛋白质组学研究人类疾病

您在Walter and Eliza Hall Institute实验室的重点领域是什么?

我们是澳大利亚领先的医学研究所之一。我经营蛋白质组平台技术实验室。作为一家研究所,我们的大部分研究都集中在癌症,免疫失调和传染病上。但是,最近,我们的研究重点已经发展到健康的发展和衰老。该研究所拥有93个实验室,拥有1000多名员工,涵盖多种疾病。员工人数意味着我们必须具有相当高的吞吐量。拥有这么多员工,考虑我们的基础架构以及如何最大程度地提高产出非常重要。

随着时间的流逝,实验室中出现的一件事是我们需要检测蛋白形式。考虑翻译后修饰(PTM)和其他翻译后作用时存在的蛋白质形式。

我们投入大量资金来了解蛋白形式的生理作用并开发技术以更好地检测它们。目前,我们正在使用质谱仪,但我们知道我们只是在看到冰山一角。尽管这些仪器非常灵敏,但动态范围是主要的限制因素,因为我们知道,细胞内以及我们分析的许多生物流体内存在的动态范围远大于我们可以检测到的范围。

为什么理解翻译后修饰(PTM)的影响为何很重要?

大多数医学研究实验室使用自下而上的蛋白质组学,并且通常专注于以基因为中心的方式(蛋白质碱基定量)使用蛋白质组学。在我们的实验室中,由于我们与许多细胞信号转导基团一起工作,因此与我们合作的许多蛋白质都在翻译后进行了修饰,因此对我们监测不同条件下的这些PTM变化非常重要。我们通常在蛋白质的背景下考虑PTM,这种蛋白质体现在“蛋白形式”的概念中,在这里我们真正对化学修饰的基因产物的功能版本感兴趣的分子。

我们可以检测到在给定的时间点在任何细胞中表达的大约11,000至13,000个基因产物,翻译后修饰可以通过RNA编辑或编码不同的SNP,转录调控,是否被截短,被蛋白酶切割,或化学修饰,例如磷酸化。还存在超过107种已知的内源性翻译后修饰。这些蛋白质样品中可能存在的复杂性是天文数字。话虽如此,我预计在任何时间点,给定细胞的蛋白形式可能约为1000万。

在我的实验室中,我们的目标是深入研究并尽可能多地关注这些基于PTM的蛋白形式。如果我们能够进行非常深入的测量,我相信我们可以开始将翻译后修饰的蛋白质与某些表型相关联。这与了解为什么我们看到表型有所不同就近了。

分析蛋白形式的最佳方法是什么?

分析这些蛋白形式和可能存在的不同形式蛋白质的最佳方法之一是分析完整蛋白质。几年前,当我们开发出一种以非常高的通量和高效的方式净化蛋白质的方法时,便致力于此工作。

我们使用顺磁珠作为成核剂来沉淀我们的蛋白形式。如果您熟悉基于树脂的SP3方法,则可以采用这种方法,但是需要额外的洗脱步骤。为此,我们从蛋白质聚集领域获得了一些知识,并结合了甲酸以非常有效且无偏的方式提取纯化的蛋白质。当您这样做时,最终会得到一种非常健壮且高度可重复的释放完整蛋白质以进行MS分析的方法。

来自LC分离的MS1信号提供了我们可以在单个shot弹枪中检测到的所有完整蛋白质的量度。平均而言,单次拍摄即可检测到大约2,000种不同形式的蛋白质,揭示出令人难以置信的基因产物异质性阵列。

我们发现,平均而言,蛋白质以大约八种不同形式(PTM形式)存在。由此,当使用自下而上的蛋白质组学时,我们知道我们正在寻找的是这是真正存在的蛋白质的冰山一角。我们知道蛋白质形式内的功能异质性要比我们目前在该领域中了解的多得多。

如果有办法更深入地研究这一点,那就太好了!我们知道,这仅仅是个开始,因为当您考虑分析完整的蛋白质时,信号强度通过同位素和电荷状态分布非常分散,这意味着我们的动态范围有限,并且我们对深层挖掘的能力有严格的限制使用这种方法进入蛋白质组。

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